色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)著分離工作的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。目前市場(chǎng)上色譜柱種類和規(guī)格繁多，在制藥、食品、環(huán)保、石化、農(nóng)林、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域有應(yīng)用廣泛，相關(guān)從業(yè)人數(shù)不斷增長(zhǎng)。

此次，我們一起來(lái)探討一下月旭色譜柱技術(shù)的特點(diǎn)及目前色譜柱技術(shù)總體發(fā)展中存在的壁壘。

作為中國(guó)知名的色譜柱品牌，月旭科技自2005年從事色譜相關(guān)業(yè)務(wù)至今已走過(guò)了14個(gè)年頭。期間，月旭科技在色譜領(lǐng)域始終堅(jiān)持自主研發(fā)和自主品牌，先后推出了包括Ultimate?、Xtimate?、Welchrom?、Topsil?和Boltimate?等多個(gè)品牌的色譜柱及色譜填料產(chǎn)品，并為客戶提供色譜分離分析技術(shù)、產(chǎn)品和整體解決方案。由于堅(jiān)持創(chuàng)新，月旭科技在色譜填料的研發(fā)和色譜分離分析方法開(kāi)發(fā)方面已經(jīng)達(dá)到國(guó)內(nèi)外ling先水平。據(jù)介紹，目前月旭團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的色譜填料超過(guò)百余種，在醫(yī)藥、食品和環(huán)境檢測(cè)方面的應(yīng)用超過(guò)5000個(gè)。其中有19款月旭色譜柱被列入美國(guó)USP-PQRI數(shù)據(jù)庫(kù)，2015版中國(guó)藥典中，有多個(gè)藥品品種指定使用月旭色譜柱產(chǎn)品。依托技術(shù)優(yōu)勢(shì)，2018年月旭色譜柱年銷量取得了超過(guò)4萬(wàn)根的好成績(jī)。以下是兩種月旭自主研發(fā)的國(guó)內(nèi)外ling先的色譜填料，一種是核殼結(jié)構(gòu)色譜填料，另一種則是體積排阻色譜填料。

該類填料更初是由zhu名色譜科學(xué)家 Jack Kirkland 在2006年研制成功的一種新型色譜填料。它是將多孔硅殼熔融到實(shí)心的硅核表面而制備的。這些多孔的“光環(huán)”狀顆粒具有極窄的粒徑分布和擴(kuò)散路徑，可以同時(shí)減小軸向和縱向擴(kuò)散，允許使用更短的色譜柱和較高的流速以達(dá)到快速、高分辨率分離。

月旭科技研發(fā)的Boltimate?核殼色譜柱中硅膠顆粒粒徑是2.7μm，它是由1.7μm直徑的實(shí)心核與0.5μm厚的多孔層所構(gòu)成的。這種核殼型的硅膠顆粒提供了較短的傳質(zhì)路徑，減少了軸向擴(kuò)散，而實(shí)心核硅膠提供堅(jiān)固的支撐結(jié)構(gòu)，可以承受高壓，具有與1.8 μm 填料相似的分離效率，且柱反壓只有sub-2μm色譜柱的50%和明顯的抗污染性能。由于實(shí)心核的存在，以及薄的多孔層，使得樣品分子的擴(kuò)散距離減小，即可以使用更高的流動(dòng)相流速，極大的提高了分析速度。目前月旭已經(jīng)有Boltimate? C18、Boltimate? LP -C18、Boltimate? EXT C18、Boltimate? Phenyl-Hexyl、Boltimate? EXT PFP等多款該系列色譜柱。國(guó)外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如AMT公司的HALO色譜柱、Sigma-Aldrich公司的Ascentis Express 核殼柱等。

核殼色譜柱填料結(jié)構(gòu)

體積排阻色譜(Size exclusion chromatography，SEC)是一種完全按照溶質(zhì)分子在流動(dòng)相溶劑中的分子尺寸大小分離的色譜法，是非常重要的分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、生物酶的工具。其分離原理如下：該類填料具有一定孔徑分布，當(dāng)具有不同尺寸的目標(biāo)物分子進(jìn)入體積排阻色譜柱時(shí)，分子量很大的分子無(wú)法進(jìn)入填料內(nèi)部孔中，因此更先被洗脫下來(lái)；分子量相對(duì)較小的分子能夠進(jìn)入一部分填料內(nèi)部孔中，因此隨后被洗脫下來(lái)；分子量很小的分子則能夠進(jìn)入到填料的所有內(nèi)部微孔中，因而其洗脫體積接近色譜柱的柱體積；根據(jù)洗脫體積的不同，可實(shí)現(xiàn)各組分之間的有效分離。體積排阻色譜填料通常是具有適合一定孔徑的球形硅膠基質(zhì)填料，由于它具有良好的機(jī)械強(qiáng)度及具有極高的分離純化效率，在生物大分子的分離分析領(lǐng)域廣泛使用。

月旭研發(fā)的Xtimate? SEC填料是在超高純?nèi)嗫坠枘z表面包覆一層具有良好穩(wěn)定性的親水性聚合物的體積排阻色譜填料，該填料的作用基團(tuán)為二醇基。這種填料表面因受二醇基官能團(tuán)保護(hù)而不與蛋白質(zhì)相互作用。使得蛋白、生物酶、多肽等樣品的非特異性吸附極小，因而廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離。目前月旭已有120A、200A、 300A、500A、700A、1000A和2000A等幾種孔徑尺寸規(guī)格的SEC色譜柱產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如TOSOH公司的TSK gel SW-型色譜填料、安捷倫公司的ZORBAX GF色譜填料等。

月旭科技色譜柱

高效液相色譜（HPLC）是一項(xiàng)高效、新穎、快速的分析分離技術(shù)，是廣泛應(yīng)用的分析手段之一。隨著科技的進(jìn)步，色譜得到了很大的發(fā)展，色譜技術(shù)性的研究在目前科研技術(shù)研究中一直占有重要定位，特別是一些相關(guān)檢測(cè)行業(yè)，應(yīng)用性研究顯得十分普遍。而色譜柱填料是各種HPLC分離模式賴以建立和發(fā)展的基礎(chǔ)，因此高性能填料成為色譜研究中更豐富、更有活力、更富于創(chuàng)造性的部分，且各種專用色譜填料的出現(xiàn)，解決了很多分析檢測(cè)中的問(wèn)題。不過(guò)由于色譜技術(shù)基礎(chǔ)性、原理性的研究發(fā)現(xiàn)還有局限，目前仍然有很多問(wèn)題解決不了的。

在強(qiáng)極性物質(zhì)保留方面，HILIC模式的提出雖然使大家看到了一線希望，不過(guò)該模式的原理研究不夠透徹全面，使得在應(yīng)用的過(guò)程中，理論不能很好指導(dǎo)實(shí)踐，這就增加了方法摸索的難度。HILIC模式的優(yōu)勢(shì)在于多種色譜作用模式能分離開(kāi)更多的物質(zhì)，且與反相和正相法有更多的正交性，但由于混合模式的多樣，使得次級(jí)吸附作用力的影響不能完全避免，導(dǎo)致強(qiáng)極性物質(zhì)在HILIC模式下的峰形問(wèn)題較大，同時(shí)色譜填料中與物質(zhì)的作用位點(diǎn)較多，使得填料的鍵合均勻度等引起的重現(xiàn)性問(wèn)題顯得尤為明顯。

其次，反相條件下使用純水流動(dòng)相也具有壁壘?，F(xiàn)在“極性改性”技術(shù)的引進(jìn)，使得非極性鍵合相的極性會(huì)有所增強(qiáng)，在極性環(huán)境（甚至是純水環(huán)境）下都會(huì)有很好的填料活性，而不會(huì)產(chǎn)生相塌陷，因此一些強(qiáng)極性物質(zhì)可以在此條件下有所保留。但是，純水流動(dòng)相對(duì)于鍵合相的洗脫能力不夠，導(dǎo)致色譜柱易吸附同極性的物質(zhì)而被污染，改性填料導(dǎo)致結(jié)果不重現(xiàn)，同時(shí)也易引起填料污染導(dǎo)致的柱壓升高、峰形異常等現(xiàn)象而縮短色譜柱的壽命。

更后，其他無(wú)機(jī)鍵合相對(duì)于強(qiáng)極性物質(zhì)保留的壁壘主要是基礎(chǔ)研究少、應(yīng)用范圍窄、價(jià)格昂貴、色譜柱維護(hù)使用不常見(jiàn)且對(duì)人員操作要求高。

在分析分離離子化物質(zhì)時(shí)，也有很多的局限性。比如反相填料+離子對(duì)試劑是現(xiàn)在普遍采用的色譜分析方式，但該方式基線平衡時(shí)間長(zhǎng)，使用后色譜柱沖洗時(shí)間長(zhǎng)，填料容易受殘留離子對(duì)試劑的影響而改性。如果用這樣的色譜柱進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，后期新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大增加，而且離子對(duì)試劑價(jià)格較貴，會(huì)增加分析成本。

離子交換法雖然專屬性強(qiáng)，是做單一物質(zhì)含量分離的良好選擇，但對(duì)于多組分分離，單一的色譜作用模式很難滿足多種性質(zhì)物質(zhì)的保留和分離，導(dǎo)致適用面較窄，而流動(dòng)相通常使用高濃度的緩沖鹽，在儀器系統(tǒng)中易析出，不利于儀器的壽命，需要加強(qiáng)對(duì)儀器的沖洗維護(hù)。此外，鍵合相的官能團(tuán)通常為小基團(tuán)試劑，在高水、高鹽、低pH條件、高溫等條件下易水解，導(dǎo)致色譜柱壽命普遍短于反相大基團(tuán)鍵合的填料。而HILIC法在分析離子化物質(zhì)時(shí)同樣有與在強(qiáng)極性物質(zhì)的保留方面相似的壁壘。

分離光學(xué)異構(gòu)體，特別是具有2個(gè)及2個(gè)以上的手性中心的異構(gòu)體時(shí)，難度會(huì)大大增加。目前市場(chǎng)上這一類物質(zhì)的分離主要用到各種手性鍵合相或者手性流動(dòng)相添加劑，其中手性鍵合相是主流。但是鍵合相大都采用涂覆工藝，有嚴(yán)格的耐受溶劑和柱壓要求，否則會(huì)加快涂覆官能團(tuán)的脫落，縮短壽命。由于對(duì)手性分離不夠全面，在選擇固定相和流動(dòng)相時(shí)，理論指導(dǎo)不夠，更多是要依靠實(shí)踐，所以增加了分析成本，降低了成功率。此外，由于手性色譜法專屬性強(qiáng)，常規(guī)要求拆分的物質(zhì)的化學(xué)純度更好在95%以上，這樣會(huì)導(dǎo)致該方法在檢測(cè)制劑時(shí)由于輔料等的干擾而不能對(duì)成品進(jìn)行質(zhì)控。

對(duì)于位置異構(gòu)體，由于物質(zhì)的極性、離子性等差異不大，目前較多的是選擇鹵代柱（PFP,F-C8）、高載碳量的C18（23%）柱、長(zhǎng)碳量的反相（C22，C30）柱等利用其空間位阻效應(yīng)將其分離。但是如果位置異構(gòu)的基團(tuán)較小，別的基團(tuán)的空間位置效應(yīng)較強(qiáng)，屏蔽了該小基團(tuán)位置差異帶來(lái)的空間差異，也將無(wú)法分離。此外，單雙鍵異構(gòu)對(duì)于現(xiàn)在的色譜技術(shù)同樣有很大的挑戰(zhàn)，目前暫時(shí)沒(méi)有有效手段能將其分離。