在離子交換過(guò)程中保持pH的恒定是十分重要的，正如前面討論過(guò)的，pH的改變會(huì)造成蛋白質(zhì)帶電荷數(shù)量和分布狀況發(fā)生變化，從而直接影響到蛋白質(zhì)是否能結(jié)合在交換劑上以及結(jié)合力的強(qiáng)弱。因此，在離子交換色譜中流動(dòng)相必須使用緩沖液。

緩沖液的種類很多，能夠起緩沖作用的物質(zhì)可分為兩類：di一類是由弱酸（或弱堿）及相應(yīng)的鹽構(gòu)成的系統(tǒng)；第二類是兼性離子化合物。對(duì)于di一類緩沖物質(zhì)，在進(jìn)行離子交換時(shí)，如果緩沖離子所帶的電荷與離子交換劑上的功能基團(tuán)相反，將參與離子交換過(guò)程，并可能對(duì)局部pH產(chǎn)生影響，因此應(yīng)盡可能采用與功能基團(tuán)帶同種電荷的緩沖離子，即：使用陰離子交換劑時(shí)選擇帶正電荷的緩沖離子；使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)選擇帶負(fù)電荷的緩沖離子。

當(dāng)然這也并不是jue對(duì)的，比如磷酸鹽緩沖液也經(jīng)常在陰離子交換過(guò)程中被采用，但在這種情況下應(yīng)特別注意在上樣前充分平衡，確保色譜系統(tǒng)的pH和離子強(qiáng)度與起始緩沖液一致。第二類緩沖物質(zhì)在陰、陽(yáng)離子交換中均能采用。表1和表2分別列出了陽(yáng)離子交換色譜和陰離子交換色譜時(shí)常用的緩沖液。

在離子交換過(guò)程中雖然可以除去很多雜蛋白，起到純化效果，但目的蛋白的洗脫峰中必然含有大量緩沖物質(zhì)和鹽的成分，這些成分的引入對(duì)于目的蛋白來(lái)說(shuō)本身也是一種雜質(zhì)。特別在色譜后需對(duì)洗脫峰進(jìn)行冷凍干燥，以得到純蛋白樣品時(shí)，在凍干后的粉末中往往絕大部分是緩沖物質(zhì)和鹽。如果在凍干前進(jìn)行脫鹽或透析操作，雖然可以基本除去這些雜質(zhì)，但也有可能造成蛋白活性的回收率下降。此時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮采用揮發(fā)性的緩沖物質(zhì)，這樣在凍干階段可以將這部分雜質(zhì)除去，常見的揮發(fā)性緩沖物質(zhì)列于表3。