離子交換層析的洗脫會受到線性或分步鹽梯度或置換展開的影響。一般更好先采用線性的鹽梯度洗脫，維持梯度約10個柱體積。在更簡單的情況下，梯度操作需兩種緩沖液，平衡緩沖液（buffer A）和用于加載相反電荷離子所用緩沖液（buffer B）。大多數(shù)情況下，并不需要后半段的梯度，因為多數(shù)蛋白質(zhì)都可以在150-500nmol/L鹽濃度下從傳統(tǒng)的離子交換劑上洗脫下來。所以，通常更大梯度到50%足矣。

分步洗脫也可通過buffer A和buffer B實現(xiàn)。也應(yīng)該意識到也許永遠(yuǎn)都不會獲得一種理想的適用于層析柱的分步洗脫。首先，鹽滯留以及HPLC的盲端體積都是決定取樣時間的因素；其次，因為緩沖液混合器的特性，僅能獲得S形曲線。根據(jù)分步洗脫中選擇的鹽濃度，蛋白質(zhì)會隨著鹽峰前端移動或移至鹽峰前端的后方。Yamamoto等將其命名為Ⅰ型或Ⅱ型洗脫。當(dāng)濃縮的洗脫物被沖洗出來之后，所選擇的鹽濃度必須適于Ⅰ型洗脫。此時的鹽濃度可能要比相應(yīng)采用線性梯度洗脫所達(dá)到的更大鹽濃度高一些。Ⅰ型洗脫所需的緩沖液小于1個柱體積。

pH梯度洗脫更難于優(yōu)化。所以，更好首先根據(jù)蛋白質(zhì)的pI找到一種條件——此時蛋白質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合。若低于pI，宜采用陰離子交換劑；若高于pI，宜采用陽離子交換劑。因此必須降低或提高pH。請記住，離子交換劑本身相當(dāng)于一種酸或堿，生成pH梯度應(yīng)遵循 滴定曲線。要獲得線性的pH梯度是十分困難的，但是采用含有二元醇的硼酸鹽緩沖液可以實現(xiàn)，如甘露醇。第四種洗脫方式是采用手動調(diào)節(jié)pH梯度進(jìn)行洗脫。當(dāng)采用10mmol/L的較低濃度緩沖液洗脫時，使用鹽可以導(dǎo)致pH梯度，這種梯度的形成是因為不同種類鹽移動情況不同。這種手動調(diào)節(jié)的pH梯度，可以用于高分辨率，另外也有利于蛋白質(zhì)峰集中。這種情況下，也需要數(shù)個柱體積的緩沖液。

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