2023-02-09
在建立一個分析方法時,我們重點(diǎn)關(guān)注的就是峰形、分離度和靈敏度。那么,影響峰形、分離度和靈敏度的因素有哪些?如何改善待分析物峰形,增大分離度,提高靈敏度呢?
01、分離模式
了解樣品的主要性質(zhì),是選擇分離模式的關(guān)鍵。針對特定的分析物,選擇合適的分離模式,是進(jìn)行有效色譜分離的首要問題。
02、固定相
色譜柱的選擇是建立液相色譜方法時必須考慮的問題,選對色譜柱往往可以實(shí)現(xiàn)事半功倍的效果。常用的色譜柱主要有C18、C8、苯基柱、氰基柱、氨基柱、離子交換柱等。
C18柱是方法篩選時更常用的色譜柱,對于疏水性較強(qiáng)(LogD>0)的待分析物往往有很好的保留。C8和C4柱等是保留能力稍弱于C18的經(jīng)典反相色譜柱。另外,根據(jù)待分析物分子量、流動相中水相比例、pH等的差異,可以選擇不同類型的色譜柱。
月旭色譜中選擇指南
苯基柱和五氟苯基柱存在中等強(qiáng)度的疏水相互作用和強(qiáng)π-π相互作用,五氟苯基柱還存在強(qiáng)的偶極作用,對于芳香族化合物,特別是苯環(huán)上的位置異構(gòu)體,常規(guī)C18無法通過疏水相互作用將其有效分離,苯基柱可以通過它們之間的π-π相互作用差異實(shí)現(xiàn)分離。
對于C18上沒有保留的化合物,氰基鍵合相是個很不錯的選擇。氰基鍵合相在正相和反相模式中均可以使用。在反相色譜中,氰基的疏水性相對較弱,且由于具有π-電子作用,適用于C18柱保留較弱的樣品。在正相色譜中,氰基的極性相對更弱,是保留能力更小的正相吸附劑。
氨基柱可用于正相、反相和弱陰離子交換,在反相條件下特別適合分析糖類物質(zhì),在正相條件下可用于分析一些溶于烷烴、烯烴和芳香烴的有機(jī)化合物,在低pH緩沖液中能分離帶負(fù)電荷的分子。
03、流動相
流動相的選擇和比例調(diào)整是開發(fā)方法更重要的環(huán)節(jié),很多時候分離度不好、峰形差的問題都可以通過調(diào)整流動相來解決。流動相的選一般遵循由強(qiáng)到弱,先粗調(diào)再微調(diào)的思路。
由強(qiáng)到弱:即首先選擇強(qiáng)洗脫條件,以快速得到分離結(jié)果,然后再根據(jù)出峰情況調(diào)整流動相比例。
先粗調(diào)再微調(diào):當(dāng)分離達(dá)到一定程度,對流動相的比例、緩沖鹽pH等條件的調(diào)整就要做的更加精細(xì),以優(yōu)化得到更佳分離條件。
04、柱溫
柱溫對保留時間、柱壓和峰形都有一定的影響。一般來說,升高柱溫,保留時間縮短,柱壓降低。但有時也會出現(xiàn)保留時間隨柱溫升高而延長的情況,特別是用鍵合極性基團(tuán)的反相柱分離一些極性化合物的時候。
對于一些拖尾較嚴(yán)重的化合物,適當(dāng)升高柱溫,可以有效改善峰形和柱效。對于大分子的分析,尤其是運(yùn)行流速較高時,適當(dāng)升高柱溫,可以降低柱壓、改善柱效。在手性分離中,一般則是低柱溫有利于提高分離度。
柱溫對峰面積的影響一般不怎么明顯,只有部分離子化合物在不同溫度下的電離程度不同,吸收波長和吸收強(qiáng)度會隨之發(fā)生變化,從而影響峰面積大小。
05、溶劑
一般情況下,溶劑對峰形的影響比較小,但是對于一些峰分叉、拖尾等異常色譜行為,也要考慮到溶劑效應(yīng)的影響。特別是在溶解樣品的溶劑強(qiáng)度大于該樣品出峰時流動相強(qiáng)度時,容易出現(xiàn)色譜峰的展寬或者分叉(反相色譜中的溶劑強(qiáng)度順序?yàn)樗技状迹家译妫家掖迹妓臍溥秽急迹级燃淄椋?/p>
另外,在進(jìn)樣體積較大或溶劑和流動相兼容性差時,也容易導(dǎo)致峰形問題,甚至是保留時間差異。溶劑和流動相的pH差異有時候會引起化合物電離狀態(tài)的變化,也會引起峰形和保留時間問題。