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案例分享 | 帶你了解多肽的分離

2022-09-29

01 多肽的性質(zhì)

多肽由多個(gè)氨基酸依次連接而成的化合物,氨基酸是兩性化合物,具有兩性離子的特性。

02 影響多肽分離的因素

1、色譜柱填料孔徑(120?、300?)

2、添加劑及濃度(甲酸、離子對試劑)

3、pH

4、洗脫溶劑(乙腈、甲醇、異丙醇)

5、梯度

6、溫度

7、流速

孔徑是指硅膠球上小孔的直徑。分子進(jìn)入小孔,在小孔內(nèi)被鍵合的烷基吸附,達(dá)到分離的效果??讖叫?,含孔率高,比表面積大,載碳量高。分子在孔內(nèi)分離,孔徑大小必須和分子大小相匹配,分子必須能進(jìn)入孔內(nèi),一般小分子使用80-120?,大分子通常使用300?,為了達(dá)到更佳分離,一般要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上。

低pH減少了酸性側(cè)鏈的解離,離子對試劑(比如三氟乙酸)與肽鏈堿性側(cè)鏈作用,中和其電性,電荷的減少使多肽的疏水作用增強(qiáng),堿性多肽側(cè)鏈與硅醇基無法產(chǎn)生吸附,但離子對試劑會使得MS的離子化效率降低。

03 項(xiàng)目案例 

液相上的分離:

色譜柱:月旭UItimate? XB-C18(2.1×100mm,5μm 300?)。

流動(dòng)相:梯度 A(0.1%三氟乙酸) B(0.1%甲酸乙腈);

柱溫:40℃;

紫外檢測器:220nm;

流速:0.3mL/min;

進(jìn)樣量:5μL。

微信截圖_20220929144647.png

討論:

多肽化合物分子量大約為2000,選擇120?孔徑和300?孔徑均可以達(dá)到有效保留,在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)120?的峰形差,分析可能是該物質(zhì)在這個(gè)體系中的分子體積較大,故在300?的柱子上峰形有了明顯的改善??梢姺肿恿靠梢杂糜谶x擇填料孔徑的參考,但不是jue對的,做多肽時(shí)建議常規(guī)孔徑120?和大孔徑300?的色譜柱都做一下嘗試,選擇更合適的孔徑;

流動(dòng)相中使用甲酸為添加劑時(shí)沒有保留,選擇具有離子對作用的三氟乙酸時(shí)保留良好,該體系是檢測多肽時(shí)的常規(guī)shou選體系,再根據(jù)該體系下的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

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