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全面解析GST親和層析

2021-06-07

1 概述

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是生物體內(nèi)的一類重要的代謝酶,參與外源和內(nèi)源有毒物質(zhì)的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽(GSH)和有毒物質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng),使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外,更終達(dá)到解毒的作用。利用這個(gè)原理,將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白,與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合,從而純化出目標(biāo)蛋白,再用特異性的酶將GST標(biāo)簽切除從而得到天然蛋白。

2 GST標(biāo)簽

GST標(biāo)簽是一種常見的標(biāo)簽,它能夠增加外源蛋白的可溶性,很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,可在不同的宿主中表達(dá),適應(yīng)范圍廣,能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性,可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性,純化方便、溫和。但它也有一定的缺點(diǎn),比如分子量較大,可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和下游實(shí)驗(yàn),因此純化后需要去除標(biāo)簽,并且如果蛋白不可溶,很難用變性的方法純化。

3 GST親和層析

GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價(jià)結(jié)合,通過GSH交換洗脫的原理來進(jìn)行純化。該純化柱中,凝膠手臂上通過硫鍵結(jié)合一個(gè)GSH,然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力,使得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結(jié)合,從而將標(biāo)簽蛋白與其他蛋白分離開。

4 月旭GST親和層析填料

1.jpg 

5 GST融合蛋白純化步驟

蛋白純化_畫板 1.png

1、將GST Tanrose 4FF 裝入合適的層析柱,層析用5倍柱體積的結(jié)合Buffer進(jìn)行平衡,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,起到保護(hù)蛋白的作用。

2、將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中(保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。

3、用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液。

4、使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer,收集洗脫液,即目的蛋白組分。

5、依次使用3倍柱體積的結(jié)合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料,更后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡,然后保存在等體積的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被細(xì)菌污染。

6 應(yīng)用實(shí)例

 圖片1.png

層析柱:PreCot 5ml GST 4FF;

樣品:重組表達(dá)GST標(biāo)簽蛋白;

結(jié)合緩沖液:20mM PB , 150mM NaCl, PH7.4;

洗脫緩沖液:15mM還原型谷胱甘肽, 50mM Tris PH 8.0。

7 常見問題解答

1. GST蛋白結(jié)合效率低,該怎么辦?

①可能原因:上樣流速太快,結(jié)合時(shí)間太短。

解決方法:降低流速,保證足夠的結(jié)合時(shí)間。

②可能原因:緩沖液不合適,柱子平衡不到位。

解決方法:將緩沖液pH控制在3-12之間,用至少5倍的柱體積平衡柱子。

③可能原因:樣品中GST融合蛋白濃度太低。

解決方法:先濃縮樣品,再進(jìn)行純化。

④可能原因:GST蛋白發(fā)生變性或聚集。

解決方法:選擇合適的細(xì)胞破碎方式;發(fā)生聚集時(shí)可嘗試添加1-10mM的DTT促進(jìn)蛋白溶解;GST蛋白與核酸結(jié)合或蛋白之間結(jié)合時(shí)可添加適量NaCl(100-300mM)。

2、GST蛋白洗脫困難,該怎么做?

①可能原因:洗脫強(qiáng)度不夠。

解決方法:增加洗脫體積數(shù);調(diào)整洗脫緩沖液pH(8-9)或離子強(qiáng)度(100-300mM氯化鈉)。

②可能原因:非特異性吸附。

解決方法:洗脫緩沖液中加入1%-2% Triton X-100。

③可能原因:洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了。

解決方法:洗脫緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用,也可嘗試加入1-5mM的DTT。

3. GST蛋白純化后純度太低,該怎么做?

①可能原因:GST融合蛋白降解。

解決方法:加入蛋白酶抑制劑防止降解。

②可能原因:在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過程中GST標(biāo)簽脫落。

解決方法:嘗試更換宿主細(xì)胞或者優(yōu)化序列。

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