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批次之間重現(xiàn)性不好?解決辦法來這找!

2019-04-30

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之前跟大家分享過一些色譜柱使用過程中的相關(guān)問題解答,包括“峰拖尾的解決思路”、“柱壓升高過快的解決思路”、“色譜柱壽命不理想的解決思路”等等(點擊藍字回看往期內(nèi)容),受到了大家的熱烈歡迎,大家對這些內(nèi)容的關(guān)注度以非常的高。

我們今天再帶來一個熱點問題的解決思路——“批次性之間重現(xiàn)性不好的解決問題”!

Q開發(fā)一個新的HPLC方法,結(jié)果認證后,方法會被轉(zhuǎn)移到QC實驗室,怎么能確保良好的重現(xiàn)性?

如果預(yù)期一個方法會被用到很多年,重現(xiàn)性將是色譜柱選擇過程中的一個重要問題,需要確認方法在使用期間,色譜柱一直都在供應(yīng),意味著選擇一家大型的愿意長期合作的廠商,選擇一種常見的鍵合相,盡量少選擇特殊或者較少使用的固定相??梢韵冗x擇一直合作的品牌開始,還應(yīng)該從廠商出獲得更多的色譜柱規(guī)格和批次重現(xiàn)性調(diào)查信息,綜合評判。

Q色譜柱的批次性重現(xiàn)之間的關(guān)系,怎么進行判斷?

以反相填料為例:同一批次的填料生產(chǎn)出不同的色譜柱,保留時間,塔板數(shù),柱壓,都會有點差異。

保留時間的改變與填料密度和色譜柱的體積成正比,色譜柱體積重現(xiàn)性取決于柱內(nèi)徑,柱內(nèi)徑改變后,保留時間會相應(yīng)改變,但分離度保持不變,那說明你的方法重現(xiàn)性還是比較好的,在我們制定方法的時候,要正確的規(guī)定方法的洗脫時間表。生產(chǎn)廠家對柱體積改變效應(yīng)造成的保留時間的改變RSD在3%左右,月旭從硬件上進行控制,將該數(shù)值控制在1%左右。

色譜柱塔板數(shù)的變化也會影響方法,特別是涉及到剛好能基線分離的一對色譜峰時,一般情況下塔板數(shù)的重現(xiàn)性在±10%左右,標準偏差減少至2-3%,但塔板數(shù)是一個平方數(shù),分離度取決于塔板數(shù)的2次方根,因此塔板數(shù)改變2%意味著峰寬變化只有1%,可以核查一下色譜柱制造商的塔板數(shù)出廠控制數(shù)據(jù)。

任何填料在生產(chǎn)的過程中,柱壓的重現(xiàn)性都比較好。

Q不同批次之前的重現(xiàn)性問題怎么去看待?

不同批次之間的色譜參數(shù)的重現(xiàn)性問題,那么上面提到的參數(shù)會有所改變,更重要的是不同批次的填料有可能引起分離選擇性的變化,一位置相對保留時間會變化,表現(xiàn)在色譜圖上的相對位置改變,不利于方法的確定。這個問題要避免的,可以從生產(chǎn)商那里收集批次重現(xiàn)性是否穩(wěn)定的信息,一般是檢測填料色譜性能的理化參數(shù)。

在理化參數(shù)中,更重要的是填料的比表面積,因為他的改變直接導(dǎo)致保留時間的改變,比表面積的變化范圍在±10%,月旭控制在±5%。

在化學(xué)參數(shù)中,鍵合相的便面覆蓋率的改變對保留時間的影響比較大,通常制造商會給出載碳量這個數(shù)值,會有一個詳細的數(shù)值,通常范圍是±10%,月旭控制在±4%以下。

制造商會有一個測試色譜重現(xiàn)性的試劑,采用尿嘧啶、苯酚、4-氯硝基苯、甲苯的混合溶液流動相是75%的有機溶劑水的中性條件,對疏水化合物之間的相對保留時間重現(xiàn)性一般比較好,而對于載碳量的改變不太敏感,較好的批次重現(xiàn)性測試是在測試混合物中加入堿性化合物,經(jīng)過優(yōu)選的堿性化合物(通常選用阿米替林)在優(yōu)化過的條件下,主要和填料上游離硅醇基相互作用,而中性化合物主要和鍵合相相互作用,這樣,堿性和中性化合物之間的相對保留時間是對反相填料批次重現(xiàn)性的嚴格測試。月旭積累了這一類批次重現(xiàn)性的測試數(shù)據(jù),并控制在一個較小的范圍內(nèi)。

Q如何確定該款色譜柱對我的實驗有較好的批次重現(xiàn)性?

上面說到的廠家對重現(xiàn)行的控制和要求,是用于選擇色譜柱的起點,更終測試是對項目本身的重現(xiàn)性測試,一些生產(chǎn)商會有不同批次的填料色譜柱包來用于具體項目測試,而另外一些生產(chǎn)商會根據(jù)客戶的需求提供類似的不同批次的色譜柱,我們需要的是不同時間鍵合相的相同填料裝填的色譜柱,而不是同一批次填料不同時間裝填的色譜柱,建議使用三個不同批次鍵合的填料裝填的色譜柱來測試方法的重現(xiàn)性,如果測試不受填料變化的影響,那可以相信該方法在幾年內(nèi)都是重現(xiàn)的。

看完這一期的“解決思路”感覺對您有所幫助嗎?如果能夠幫到您那就是我們更開心的了,針對色譜柱的使用維護您還有什么問題想要尋求幫助與解答嗎?可以在文末留言,我們會選擇提問頻率較高的問題來為大家解答!

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