2020-10-28
梯度優(yōu)化在液相色譜方法開發(fā)中是非常重要的一個環(huán)節(jié)。有時,一個合適的梯度洗脫程序?qū)σ合嗌V分析分離可起到“四兩撥千斤”的作用。然而,許多小伙伴由于梯度優(yōu)化實驗做得相對較少,因此誤認為梯度優(yōu)化非常復(fù)雜。今天小編就帶大家來揭開反相液相色譜梯度程序的神秘面紗,一探梯度優(yōu)化的究竟。
一、建立梯度方法的原因
Q 為什么要用梯度的方式來洗脫呢?
當(dāng)然,作為分析工作者,如果能以一個等度的條件完成我們的分離目的,那便是是皆大歡喜的,但實際情況常常不能如我們所愿?;旌蠘悠方M分中,必定存在容易分離和不易分離的組分,保留較弱和保留較強的組分。
我們建立梯度洗脫程序的目的就在于,將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動相中實現(xiàn)盡快分離,而保留較強的組分在色譜柱內(nèi)停留較長時間,與鍵合相表面發(fā)生充分的相互作用,盡可能地彼此拉開,更后用強洗脫能力的流動相洗脫出來,避免洗脫時間過長。
二、反相液相色譜體系流動相的洗脫能力
Q 前文既然講到了流動相的洗脫能力,那么,反相色譜中,如何來判斷流動相的洗脫能力呢?
我們可以來看一下下面這張圖:
上圖各位小伙伴應(yīng)該都不陌生,所述的原理即是,在反相體系中,隨著流動相的極性不斷增加(水相的比例在不斷增加),流動相整體的洗脫能力逐漸減弱,而保留時間則在逐漸延長。因此,前文中對于容易分離的組分,可嘗試在流動相極性較大的環(huán)境下將其實現(xiàn)分離。
同時,為了提高整個樣品混合組分的分離度,在整個梯度程序內(nèi),也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此,對于很多小伙伴,在進行一個全新的項目的反相條件方法開發(fā)的時候,更chang用的初始梯度模式便是在0~40min內(nèi),進行一個95%水相→1OO%有機相的線性洗脫。
三、反相液相色譜梯度優(yōu)化中心思路
反相色譜梯度優(yōu)化的中心思路,其實就是盡可能減弱流動相的洗脫能力,從而減少共洗脫的情況。減弱流動相洗脫能力更y效的方式是更換洗脫強度弱一些的溶劑,或者增減流動相中的添加劑。
然而,很多情況下,小伙伴參照既定標(biāo)準進行實驗,溶劑種類和添加劑的量不便進行過多的調(diào)整,這樣的情況下,還有一個方法可以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度,那就是減緩流動相的變化斜率。我們通過下面這個案例給大家說明:
通過上圖我們可以看到,在梯度(一)條件下,多潘立酮和雜質(zhì)D出現(xiàn)共洗脫,峰重疊。于是我們進行梯度程序的調(diào)節(jié):
在梯度(二)中,10min時乙腈的比例為45%,而梯度(一)下10min時乙腈的比例為60%,并且梯度(二)中的后7min,乙腈的比例也并未繼續(xù)升高至100%,這就使得梯度(二)條件中,每時每刻乙腈的比例都低于梯度(一),暨每時每刻流動相的洗脫強度都弱于梯度(一),如下圖。如此一來,各雜質(zhì)共洗脫的情況得到改善,結(jié)果就是如圖3所示,8個物質(zhì)都得到了分離。
四、注意事項
在進行方法開發(fā)梯度優(yōu)化的時候,一定要注意兼容性的問題,包括流動相溶劑彼此之間的兼容性,以及流動相和樣品的兼容性。
流動相溶劑選擇上,更 hou是選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動相溶劑不方便更換,則需盡量減緩流動相的變化速率,給有機相和水相(鹽相)更多的時間來互溶。
對于樣品來說,流動相的性質(zhì)一定要注意與樣品溶劑能夠兼容,避免出現(xiàn)在進樣后的任意時刻樣品不溶解、析出的情況。