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2020-04-16
His標(biāo)簽融合蛋白的純化是借助于層析介質(zhì)上的過(guò)渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等)與His融合蛋白上的His標(biāo)簽的配位作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分離。組氨酸(His)的殘基上帶有1個(gè)咪唑基團(tuán),可以和Ni2+等過(guò)渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上,這些金屬離子通過(guò)螯合配體固定在層析介質(zhì)上,因此帶有His標(biāo)簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過(guò)渡金屬離子的層析介質(zhì)上,而其他不含His標(biāo)簽的雜質(zhì)蛋白則不能吸附或僅微弱吸附在介質(zhì)上。通過(guò)提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫,可以將His標(biāo)簽融合蛋白從層析介質(zhì)上解吸附下來(lái),從而得到較高純度的目標(biāo)蛋白。
常用的His標(biāo)簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF(NTA/IDA)金屬螯合親和填料,但是在使用過(guò)程這種常常會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題,這里就給各位老師介紹下常見(jiàn)問(wèn)題和解決方案
填料清洗
當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí),需要進(jìn)行在位清洗操作 (Cleaning-in-Place,CIP)。
建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白,脂蛋白和脂類(lèi)
通過(guò)使用 30%異丙醇清洗 5-10 個(gè)柱體積,接觸時(shí)間為 15-20 分鐘可以去除此類(lèi)污染物。然后,再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液, 清洗填料 2 倍柱體積。例如,含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液,接觸時(shí)間 為 1–2 小時(shí)。去污劑處理后,需要使用 70%的乙醇清洗 5 個(gè)柱體積,以徹底去除去污劑。更后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。
去除離子作用結(jié)合的蛋白
使用 1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為 10-15 分鐘清洗。然后,再使用去離子水清洗 10 個(gè)柱體 積。
填料再生
組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使 用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,或者填料載量明顯變低時(shí),需要進(jìn)行對(duì)填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子,也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi),按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。
1. 使用 0.2 M 醋酸溶液(含 6 M GuHCl)清洗 2 倍柱體積;
2. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;
3. 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體積;
4. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;
5. 使用乙醇清洗 5 倍柱體積;
6. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;
7. 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積;
8. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;
9. 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積;
10. 使用去離子水清洗 10 倍柱體積;填料再生后,可以立即使用,也可以保存在 20%的乙醇中,置于 4°C 保存。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
01. 蛋白不掛柱
可能原因:His標(biāo)簽是否丟失
解決方案:大腸桿菌表達(dá)外源蛋白過(guò)程中,常出現(xiàn)序列丟失的現(xiàn)象,若是標(biāo)簽丟失,蛋白自然就無(wú)法掛柱了。可采用Western-Blot方法通過(guò)His抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否存在His標(biāo)簽。
可能原因:His標(biāo)簽是否暴露在融合蛋白表面
解決方案:在蛋白中加入適量的尿素或者鹽酸胍等變性劑,若此時(shí)蛋白可以?huà)熘f(shuō)明蛋白表達(dá)過(guò)程中His標(biāo)簽可能暴露不充分,這個(gè)時(shí)候可以嘗試在緩沖液中加入變性劑進(jìn)行純化。若因蛋白本身原因不能添加變性劑,則只能?chē)L試上游條件的修改,要么增加His標(biāo)簽長(zhǎng)度,提高標(biāo)簽暴露的幾率,要么修改His標(biāo)簽的位置。
可能原因:更換過(guò)渡金屬離子
解決方案:如果選擇用的是Ni2+或Co2+,換成Cu2+或Zn2+則就有可能掛柱了。
可能原因:緩沖液選擇是否正確
解決方案:如果緩沖液中需要添加巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑,則需要選擇具有NTA配基的螯合介質(zhì)(常規(guī)條件下選擇IDA配基的螯合介質(zhì)即可)。
如果緩沖液中含有EDTA等具有強(qiáng)螯合作用的試劑,應(yīng)在純化前去掉。
此外,適當(dāng)提高緩沖液pH值、降低緩沖液中的鹽濃度或者更換成磷酸鹽緩沖液都可能提高His標(biāo)簽蛋白的掛柱能力。
可能原因:提高接觸時(shí)間
解決方案:適當(dāng)降低流速,提高蛋白與螯合介質(zhì)的接觸時(shí)間,可以提高目標(biāo)蛋白的掛柱能力。
02. His標(biāo)簽蛋白掛柱后洗脫不下來(lái)
可能原因:洗脫強(qiáng)度不夠
解決方案:可適當(dāng)增加洗脫液中咪唑的濃度或者降低pH值。
可能原因:蛋白和層析介質(zhì)之間存在非特異性吸附
解決方案:可以嘗試在洗脫液中添加去垢劑(如0.2%的TritionX-100)。
可能原因:蛋白是否沉淀在層析介質(zhì)內(nèi)部
解決方案:可以嘗試降低上樣量或通過(guò)咪唑梯度洗脫的方式來(lái)避免蛋白沉淀。
可能原因:改變緩沖液條件
解決方案:降低緩沖液pH、提高咪唑濃度、提高鹽濃度或者換成Tris-HCl緩沖液都有可能解決目標(biāo)蛋白洗脫不下來(lái)的問(wèn)題。
可能原因:更換過(guò)渡金屬離子
解決方案:如果用的是Ni2+,可以嘗試換成Co2+,降低目標(biāo)蛋白與過(guò)渡金屬離子的螯合作用。
03. 洗脫后的His標(biāo)簽蛋白純度不夠
可能原因:優(yōu)化過(guò)渡金屬離子種類(lèi)
解決方案:純度不夠的主要原因是宿主細(xì)胞蛋白中的一些含有組氨酸的雜蛋白吸附在鏊合介質(zhì)上。因此,可以采用螯合能力弱的Co2+作為過(guò)渡金屬離子,使得含有組氨酸的雜蛋白無(wú)法吸附在介質(zhì)上,從而提高目標(biāo)蛋白的純度。
可能原因:優(yōu)化上樣和洗脫條件
解決方案:尋找更優(yōu)的上樣和洗脫條件,抑制雜蛋白的吸附(如增加上樣緩沖液中咪唑的濃度),將雜蛋白和目標(biāo)蛋白盡可能的分開(kāi)。
可能原因:雙標(biāo)簽純化
解決方案:在進(jìn)行上游構(gòu)建時(shí),給目標(biāo)蛋白加雙重標(biāo)簽,通過(guò)兩步親和層析,提高目標(biāo)蛋白的純度。
可能原因:多步純化
解決方案:在金屬螯合層析之后,根據(jù)蛋白分子量大小和帶電荷情況,加一步凝膠過(guò)濾層析或者離子交換層析,嘗試將目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)進(jìn)一步分離開(kāi)來(lái),提高目標(biāo)蛋白純度。
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