反相色譜柱中使用更多的就是硅膠基質(zhì)色譜柱。硅膠基質(zhì)的表面有許多殘留的硅醇基，圖1顯示了硅醇基可能存在的多種形式。在弱酸性環(huán)境中，這些硅醇基能和特定的化合物和基質(zhì)成分特別是堿性化合物發(fā)生相互作用，導(dǎo)致堿性化合物吸附于硅膠表面。同時(shí)，硅膠中殘留的重金屬離子會將酸性更強(qiáng)的物質(zhì)引入到硅膠表面中。另外，硅膠也會與金屬螯合物或清潔劑發(fā)生相互作用。

例如，像玉米油，gai級芳香化合物和蠟這樣的樣品基質(zhì)會粘附在反相填料表面并改變其性質(zhì)，含有蛋白質(zhì)成分的生物樣品也會吸附在填料顆粒表面，即使采用樣品前處理的方法來避免外來物質(zhì)的污染以保護(hù)色譜柱，更終待測物的基質(zhì)仍然會吸附在色譜柱表面。色譜柱在被污染后的色譜行為會不同于未被污染的色譜柱。

通常樣品基質(zhì)中會含有一些與目標(biāo)分析物無關(guān)的污染物。比如鹽，酯類，脂肪族化合物，有機(jī)酸，疏水性蛋白和其他生物組分，這些都是可能與固定相發(fā)生相互作用的物質(zhì)。與目標(biāo)分析物相比，這些污染物的保留能力可能更強(qiáng)。一旦這些預(yù)料之外的污染物被檢測器檢測到，在色譜圖上則表現(xiàn)為色譜峰分叉，基線波動甚至是負(fù)峰。

如果污染物在色譜柱上的保留能力很強(qiáng)，流動相的洗脫能力不足以將這些污染物沖出來，那么在多次進(jìn)樣后，這些吸附在色譜柱上的污染物就會聚集。當(dāng)污染物積累足夠多時(shí)，它們就會像改性填料一樣表現(xiàn)出相應(yīng)的性質(zhì)，目標(biāo)分析物與這些污染物的相互作用會影響其原本的分離機(jī)制，導(dǎo)致保留時(shí)間波動和峰拖尾。如果污染物更多，則柱壓可能升至很高的水平，甚至超過柱壓上限。

叁·沖洗反相色譜柱

月旭色譜柱推薦正向使用，反向沖洗。

由于絕大多數(shù)保留能力強(qiáng)的污染物通常位于色譜柱柱頭端，因此反沖色譜柱可以大大縮短污染物離開色譜柱需經(jīng)過的距離。月旭色譜柱兩端所用篩板孔徑一致，不會出現(xiàn)反沖時(shí)將填料沖出的問題。大多數(shù)現(xiàn)代不銹鋼色譜柱是在比日常使用壓力更高的壓力條件下充填的，因此在反沖時(shí)柱床通常不會受到影響。

對反相柱進(jìn)行柱清洗的頻率取決于強(qiáng)保留性物質(zhì)進(jìn)入到色譜柱的多少。由于反相色譜柱在表現(xiàn)出分離度下降或釋放異常物質(zhì)之前能夠耐受較大程度的污染，因此用戶通常等觀察到色譜柱異常后才會進(jìn)行沖洗，但是污染物的堆積會使清洗工作變得更為困難?；谶@個(gè)原因，如果有的樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，建議定期對色譜柱進(jìn)行沖洗。對色譜柱沖洗的頻率越高，所需的沖洗程序也就越簡單。

（當(dāng)色譜柱出現(xiàn)柱壓升高、峰型異常、柱效下降、分離度下降）

肆·沖洗反相色譜柱的殘留蛋白質(zhì)

如果污染物是生物類，比如血漿，血清，蛋白質(zhì)和多肽在反相色譜柱上聚集，通常乙腈或甲醇這樣的純有機(jī)溶劑難以溶解這些污染物。然而，有機(jī)溶劑與緩沖鹽、酸或者離子對試劑混合溶劑能沖洗掉生物類污染物。

如果色譜柱被生物類樣品污染，推薦使用乙腈：水：三氟乙酸 （50/50/0.1）為流動相，在做樣流速下反向沖洗60倍柱體積，并在進(jìn)樣前用初始流動相對色譜柱進(jìn)行平衡，那么色譜柱對生物類樣品的分離能力就可以恢復(fù)。

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